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一氧化氮（Nitric oxide，NO）含量測定試劑盒說明書
微量法
注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
NO（Nitric Oxide，NO）廣泛分布于生物體內神經、循環、呼吸、消化、泌尿生殖等系統中，特別是神經組織中較豐富。它作為細胞間及細胞內的信息物質，發揮信號傳遞的作用，是一種新型的生物信使分子，在機體的生理、病理過程中起著重要的作用。
測定原理：
NO在體內或水溶液中極易氧化生成 NO2-，在酸性條件下，NO2-與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物，進一步與萘基乙烯基二胺偶合，產物在550nm處有特征吸收峰，測定其吸光值，可以計算NO含量。為了排除樣品色素等的影響，每個樣品需做對照管。
自備實驗用品及儀器：
天平、研缽或勻漿器、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 3mL×1 瓶，4℃避光保存。
試劑二：液體 3mL×1 瓶，4℃保存。
試劑三：液體 6mL×1 瓶，4℃避光保存。
樣品處理：
1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿。10000g，4℃離心 15min，取上清，置冰上待測。
2. 細菌、真菌：按照細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；然后10000g，4℃，離心 15min，取上清置于冰上待測。
3. 體液和培養液等其它液態樣品：直接測定。
測定步驟和操作表：
1、 分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至550nm。
2、 操作表
對照管 | 測定管 | |
樣品（μL） | 100 | 100 |
試劑一（μL） | 50 | |
試劑二（μL） | 50 | |
試劑三（μL） | 50 | 50 |
混勻，室溫靜置 15min，于微量石英比色皿/96 孔板，對照管調零，測定 550nm 處吸光 值，記為 A 550 。 | ||
NO 含量計算：
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標準曲線回歸方程為：y=0.016x-0.0103，R2=0. 9986
1、組織樣品：
NO含量定義：25℃時，每克樣品或每毫克蛋白15min生成1μmoL NO2-，相當于1μmoL NO。
（1）按樣本質量計算
NO 含量（μmoL/g）=（A 550 +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W）×10 -3
= 0.125×（A 550 +0.0103）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計算
NO 含量（μmoL/mg prot）=（A 550 +0.0103）÷0.016×V 反總÷（V 樣×Cpr）×10 -3
= 0.125×（A 550 +0.0103）÷Cpr
2、其他樣品：
NO 含量定義：25℃時，每升樣品15min生成 1μmoL NO2-，相當于1μmoL NO。
NO 含量（μmoL/L）=（A 550+0.0103）÷0.016×V 反總÷V 樣
= 125×（A 550+0.0103）
V 反總：反應總體積，0.2mL；V 樣：反應中樣品體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL
b. 用 96 孔板測定的計算公式如下
標準曲線回歸方程為：y= 0.008x-0.0103，R2=0. 9986
1、組織樣品：
NO含量定義：25℃時，每克樣品或每毫克蛋白15min生成 1μmoL NO2-，相當于1μmoL NO。
（1）按樣本重量計算
NO 含量（μmoL/g）=（A 550 +0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×W）×10 -3
= 0.25×（A 550+0.0103）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計算
NO 含量（μmoL/mg prot）=（A 550+0.0103）÷0.008×V 反總÷（V 樣×Cpr）×10 -3
= 0.25×（A 550+0.0103）÷ Cpr
2、細胞
NO 含量定義：25℃時，每104個細胞15min 生成 1μmoL NO2-，相當于1μmoL NO。
NO 含量（μmol/104cell）=（A 550+0.0103）÷0.008×V反總÷（V樣÷V樣總×細胞數量）×10 -3= 0.25×（A 550+0.0103）÷細胞數量（萬個）
3、 其他樣品：
NO 含量定義：25℃時，每升樣品 15min 生成 1μmoL NO2-，相當于1μmoL NO。
NO 含量（μmoL/L）=（A 550 +0.0103）÷0.008× V 反總÷V 樣= 250×（A 550 +0.0103）
V 反總：反應總體積，0.2mL；V 樣：反應中樣品體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，
1mL；W：樣品質量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL
